目前生物柴油主要采用化学法生产，现正在研究生物酶法合成生物柴油技术。用发酵法（酶）制造生物柴油，混在反应物中的游离脂肪酸和水对酶催化剂无影响，反应液静置后，脂肪酸甲 酯即可分离。日本大阪市立工业研究所成功开发使用固定化脂酶连续生产生物柴油，分段添加甲醇进行反应，反应温度为30℃，植物油转化率达95%，脂酶连续使用100 天仍不失活。反应后静置分离，得到的产品可直接用作生物柴油。
通过加氢裂化方法也可生产生物柴油，现已开发了几种新工艺。加氢裂化方法不联产丙三醇。可将植物油转化为高十六烷值低硫柴油，可加工宽范围原料包括高含游离酸的物料。加氢裂化过程中发生几种反应，包括加氢裂化、加氢处理和加氢。产率为75%～80%，十六烷值高，硫含量＜ 10PPm。28 天后可生物降解95%，而石油基柴油在同样时间内降解40%。与其他生物柴油比，主要优点是可降低NOx 排放。该工艺采用常规的炼厂加氢处理催化剂和氢 气，可供炼油厂选用，因有氢 气可用，可方便地与炼油厂组合在一起。
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